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线粒体异含量试剂盒,线粒体异活性测试盒 |
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线粒体异含量试剂盒
测定意义:
ICDHm(EC 1.1.1.41)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,在三羧酸循中催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸,同时将NAD+ 还原为NADH,是三羧酸循环的限速酶之一,其催化的反应是细胞NADH主要来源之一。
注 意 :
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定原理:
ICDHm催化NAD+ 还原生成NADH,导致340nm处光吸收上升。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
1、称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆600g,4℃离心5min。
3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心10min。
4、上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的ICDHm(此步可选做)。
5、在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体ICDHm活性测定。
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