兔嗜酸性白血球相关之RNA水解酵素家族成员1(EAR1)ELISA试剂盒

兔嗜酸性白血球相关之RNA水解酵素家族成员1(EAR1)ELISA试剂盒

操作步骤：1.从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 4℃。2. 设置品孔、样本孔和空白孔，空白孔什么都不加；品孔各加不同浓度的品 50μL；3. 待测样本孔先加待测样本 10μL，再加样本稀释液 40μL；4. 随后品孔和样本孔中（空白孔不加）加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测 50μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育 60min。5. 弃去，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗 板 5 次（也可用洗板机洗板）。6. 所有孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。7. 所有孔加入终止液 50μL，15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。

试剂盒组成：

注意：使用前请检查试剂盒中试剂的标签和数量与表格是否一致。

兔嗜酸性白血球相关之RNA水解酵素家族成员1(EAR1)ELISA试剂盒

点ELISA：与常规的微量板ELISA比较，Dot-ELISA具有简便、节省抗原等优点，而且结果可长期保存；但其也有不足，主要是在结果判定上比较主观，特不够高等。该的主要操作程序为：⑴载体膜的预处理及抗原包被　取纤维素膜用蒸馏水浸泡后，稍加干燥进行压圈。将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈中，置37℃使纤维素膜干燥。每张7cm×2.3cm的膜一般可点加40－53个样品，每个压圈可加抗原液1－20μl。⑵ 封闭　将纤维素膜置于封闭液中，37℃感作15－30分钟。封闭液多采用含有正常动物、pH7.2或pH7.4的PBS。⑶ 加被检　可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量适度稀释的待检，37℃反应一定时间，用洗涤液洗三次，每次1－3分钟。洗涤液一般为一定浓度的PBS-Tween溶液。⑷ 加酶标，37℃反应一定时间后，用洗涤液洗三次。⑸显色　加入新鲜配制的底物液，37℃反应一定时间后，去掉底物液，加蒸馏水洗涤终止反应。⑹ 结果判定　以阳性、阴险作为对照，膜片出现深棕红色点者为阳性反应，否则为阴性反应。

试剂盒操作步骤：

   实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1.加样：分别设空白孔、孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。 为实验结果有效性，每次实验请使用新的品溶液。

2.弃去，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记工作液 100μl（取1μl生物素标记加99μl生物素标记稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用小时内配制），37℃,60分钟。

3.温育60分钟后，弃去孔内，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记工作液） 100μl，37℃，60分钟。

5.温育60分钟后，弃去孔内，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时可见品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。

标本的采集及保存：

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  ：全血标本请于室温放置2小时或4℃过一晚后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
  

  
  


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  ：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
  

  
  


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  细胞物上清或其它生物标本：1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 (注：标本溶血会影响**检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。)
  

  
  


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  标本的稀释原则：通过文献检索的了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的中，应做好详细的记录。计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。
  

  
  


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  品的稀释原则：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为300 pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，样品稀释液直接作为浓度0 pg/ml，临用前15分钟内配制。 如配制150 pg/ml品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述品加入含0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
  

  
  


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  生物素标记的稀释原则：临用前以生物素标记稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素标记加990μl生物素标记稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用小时内配制。
  

  
  


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  辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则：临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根过氧化物酶标记亲和素加990μl辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 的比例配制，轻轻混匀，在使用小时内配置
  

  
  

双夹心ELISA：此法与双夹心ELISA的主要区别在于：它是采用酶标抗检查多种大分子抗原，它不仅不必标记每一种，还可试验的性。此法的基本程序为：① 加（Ab-1）包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干② 加待检抗原（Ag） → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干③ 加用非同种动物生产的特（Ab-2)→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干④ 加入酶标抗Ab-2（AB-3）→ 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干⑤ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液⑥ 用ELISA检测仪测定OD值。

实验结果计算：

    以物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出曲线，根据样品的OD值由曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用物的浓度与OD值计算出曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

绘制曲线：在Excel工作表中，以品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

注意事项：

1.当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。

2.洗涤非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

3.一次加样时间**控制在5分钟内，如标本数量多，建议使用排枪加样。

4.请每次测定的同时做曲线，做复孔。

5.如标本中待测含量过高，请先稀释后再测定，计算时请乘以稀释倍数。

6.在配制品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

7.底物请避光保存。

8.不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。

试剂盒性能

1．准确性：品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。

2．灵敏度检测浓度小于10 pg/ml。

3．特：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4．重复性：批内与批见应分别小于9%和15%。