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转氢酶-2活性试剂盒,转氢酶-2检测试剂盒 |
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转氢酶-2活性试剂盒
测定意义：
TH位于线粒体的内膜上，又称为线粒体复合体六，催化NADH+NADP+和NAD++NADPH相互转化，调节线粒体NAD(H)和NADP(H)平衡。把逆向反应称为TH-2，催化NADPH和NAD+生成NADP+和NADH。
测定原理：
NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD+）替代NAD+，TH-2催化APAD+还原生成APADH，APADH在375nm有特征光吸收，测定375nm光吸收的增加速率，来计算TH-2活性。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
注 意 ：
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
①准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
②将匀浆600g，4℃离心5min。
③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
④上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的TH-2（此步可选做）。
⑤步骤④中的沉淀即为线粒体，加入500uL试剂二，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于TH-2活性测定。
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